Geeni redigeerimine on DNA sihipärane modifitseerimine genoomis kindlas kohas, näiteks järjestuse kustutamine, sisestamine või asendamine.
Enamikus kaasaegsetes töövoogudes töötavad kolm mehhanismi:
- Sihtimine.Programmeeritav molekul, tavaliselt juht-RNA, suunab redigeeriva ensüümi sobivale DNA järjestusele.
- Lõikamine või muutmine.Nukleaas, nagu Cas9, tekitab tavaliselt sihtkohas katkestuse. Uuemad tööriistad (baas- ja põhiredaktorid) muudavad DNA-d ilma täieliku topelt-ahela katkemiseta.
- Mobiilside parandamine.Rakk parandab muutuse. Error-prone repair (NHEJ) kipub geeni häirima. Malli-juhitud parandamine (HDR) võib sisestada määratletud jada.
Traditsioonilised meetodid vs geenide redigeerimine
| tegur | Traditsioonilised lähenemisviisid (aretus, juhuslik mutagenees, klassikaline transgeensus) | Programmeeritav geenide redigeerimine |
| Täpsus | Madal; muutused on sageli juhuslikud või neid on raske leida | Üldiselt tuleb hinnata kõrgeid, kuid{0}}sihtväliseid mõjusid |
| Ajaskaala | Kuudest aastateni | Olenevalt mudelist sageli nädalaid kuni kuid |
| Disaini pingutus | Läbivaatus-raske | Raske esi{0}}disain, hiljem vähem ekraani |
| Labori nõuded | Lai, üldotstarbeline{0}} | Tavaliselt on vaja kontrollitud raku{0}}kultuuri ja molekulaarseid töövooge |
| Regulatiivne tähelepanu | Varieerub | Erineb jurisdiktsiooni ja rakenduse järgi; institutsionaalne bioohutuse ülevaatus on tavaline |
Otsuste rusikareegel:
- Kui teie eesmärk on akonkreetne, määratletudgeenimuutus, programmeeritav redigeerimine sobib üldiselt paremini.
- Kui vajate laiaulatuslikku ja erapooletut variatsiooni ja saate endale lubada sõelumist, võib traditsiooniline mutagenees siiski olla mõttekas.
- Kui teie meeskond tegeleb redigeerimisega sagedamini kui aeg-ajalt, planeerige ruum töövoo järgi, mitte ei kohanda seda hiljem.
Tehnilised põhikomponendid
Programmeeritav nukleaas.CRISPR{0}}seotud ensüümid (Cas9, Cas12 variandid) on kõige levinumad. Vanemaid tööriistu, nagu ZFN-id ja TALEN-id, on tavaliselt raskem uuesti-sihtida, kuna iga uus sihtmärk nõuab tavaliselt äsja valmistatud valku.
Juht-RNA (gRNA).See lühike RNA määrab, kus toimetaja tegutseb. Disaini kvaliteet mõjutab tugevalt nii tõhusust kui{1}}sihtmärgivälist riski.
Parandage rada ja mall.Tulemus sõltub sellest, kuidas rakk katkestuse parandab. Täpse sisestamise jaoks on tavaliselt vaja doonori malli.
Kohaletoimetamise viis.Valikud hõlmavad elektroporatsiooni, lipiidide nanoosakesi, viirusvektoreid ja otsest ribonukleoproteiini (RNP) kohaletoimetamist. Valik sõltub tavaliselt raku tüübist, mastaabist ja ohutusnõuetest. See kujundab ka pingiruumi, jäätmekäitluse ja isoleerimise vajadused.
Kuidas see ühendub BOKA laborilahendustega
Geeni redigeerimine ise on bioloogia otsus. See, kas see töötab usaldusväärselt, on osaliselt infrastruktuuri otsus. BOKA ei tarni redigeerimisreaktiive. Kujundame ja ehitame laborikeskkonna töövoo ümber.
Enamikus redigeerimislaborites näevad integreerimispunktid välja järgmised:
Labori pingid.Kemikaalide-kindlad, kergesti-puhastatavad-pinnad toetavad rutiinset raku-kultuuri ja molekulaarset tööd. Paigutused võivad ristsaastumise vähendamiseks eraldada eel- ja järel-võimenduse etapid.
Ventilatsiooni- ja puhastussüsteemid.Kontrollitud õhuvool ja õhupuhastus aitavad säilitada stabiilset töökeskkonda. Nõuded sõltuvad teie riskihinnangust.
Tõmbekapid.Vajalik, kui töövood hõlmavad ohtlikke kemikaale, näiteks ekstraheerimise või puhvri ettevalmistamise ajal.
Keskjaamad ja abilauad.Need toetavad paindlikke jagatud tööruume ja seadmeid, nagu tsentrifuugid ja termotsüklerid.
Lagede teenindussambad jagaasipudeli kapid.Need pakuvad organiseeritud juurdepääsu elektri-, andme- ja gaasiteenustele (nt CO₂ inkubaatorite jaoks) väiksema segadusega pingi tasandil.
Bioohutuskapid, isoleerimistasemed ja sertifikaadid järgivad üldiselt teie asutuse bioohutuse ülevaatust. Tavaliselt planeerime ruumi paigutuse, kommunaalkulud ja õhuvoolu vastavalt nendele nõuetele juba projekteerimisetapis.
Kuhu see sobib ja kuhu mitte
Üldiselt sobib hästi:
- Akadeemilised või institutsionaalsed uurimislaborid, mis loovad raku{0}}liini või mudel{1}}organismide redigeerimise võime
- Biotehnoloogia alustavad-ettevõtted loovad oma esimesed molekulaarbioloogia ja raku{1}}kultuurikomplektid
- Põhiseadmed, mis toetavad jagatud seadmetega mitut redigeerimisprojekti
- Õppelaborid, mis tutvustavad genoomi{0}}inseneritehnikaid
- Olemasolevad laborid, mis laienevad redigeerimisele ja vajavad tsoneeritud paigutust parema õhuvoolu ja utiliitide juurdepääsuga
Üldiselt ei sobi:
- Meeskonnad, kes otsivad redigeerimisreagente, ensüüme või sünteesiteenuseid. BOKA neid ei paku.
- Projektid, mis nõuavad konkreetset sertifitseeritud isolatsioonitaset ilma institutsionaalse riskihinnanguta. Tavaliselt tuleb see hinnang olla esimene.
- Ühekordsed-eksperimendid, mida saab läbi viia lepingulise uurimisorganisatsiooni kaudu, kus spetsiaalset ruumi on raske õigustada.
KKK
Kas geenide redigeerimine on sama mis geenitehnoloogia?
Mitte täpselt. Geenitehnoloogia on laiem mõiste. Geeni redigeerimine viitab tavaliselt täpsetele, sihipärastele muudatustele määratletud kohas.
Kas CRISPR on ainus geenide{0}}redigeerimise meetod?
Ei. ZFN-id ja TALEN-id on samuti olemas. CRISPR-i eelistatakse selle paindlikkuse ja madalamate projekteerimiskulude tõttu.
Kas geenide redigeerimine vajab spetsiaalset laborit?
Enamikul juhtudel vajab see kontrollitud raku{0}}kultuuri ja molekulaarset töövoogu, mitte ühte kindlat ruumitüüpi. Nõuded sõltuvad organismist, vektoritest ja kohalikest eeskirjadest.
Kas BOKA saab aidata selle töö jaoks laborit planeerida?
Jah, paigutuse, pinkide, ventilatsiooni, puhastamise ja kommunaalteenuste jaoks. Bioloogilised protokollid ja bioohutuse kinnitus jäävad teie asutusele.
Kas plaanite geenide{0}}redigeerimise tööks laborit?Jagage oma töövoogu ja ruumipiiranguid ettevõttegaBOKAmeeskond. Saame teiega enne ehituse algust üle vaadata planeeringu, õhuvoolu ja kommunaalteenuste nõuded.